病毒,一類嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。在宿主細(xì)胞外環(huán)境，病毒既不能獨(dú)立進(jìn)行代謝活動(dòng)，也不能進(jìn)行繁殖，只能以顆粒形態(tài)存在，即病毒體(virion)的形態(tài)存在。病毒死亡，由蛋白質(zhì)外殼的分裂和核酸退化導(dǎo)致的病毒濃度隨時(shí)間的降低。死亡的病毒不會(huì)感染宿主細(xì)胞, 因而喪失對(duì)人畜健康危害（沒有生物活性，不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，也不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制）[1]。清除病毒的方法有很多，按病毒去除/滅活方式的不同，可分為有機(jī)溶劑/去污劑（S/D)法、低pH值孵放法、膜過濾法、紫外法、超短時(shí)微波加熱法、巴氏消毒法和干熱法等[24]。下面將介紹一些常見病毒去除/滅活方法。
病毒去除/滅活技術(shù)介紹
2.1有機(jī)溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法
過去，人們發(fā)現(xiàn)甲肝病毒能通過消化道傳播，乙肝病毒通常不能通過消化道傳播，但是在膽汁分泌障礙人群體內(nèi)，乙肝病毒能通過消化道傳播的概率較高。后來，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，這與膽汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有關(guān)。根據(jù)以上原理，通過研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，使用Triton-X 45這類的非離子型表面活性劑（去污劑）和磷酸三丁酯（有機(jī)溶劑）能夠有效破壞類似乙肝病毒的類脂膜：類脂從病毒表面脫落，使病毒失去黏附和感染細(xì)胞的能力，從而達(dá)到滅活病毒的效果，且對(duì)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)的影響也非常小[4]。這種方法就是有機(jī)溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法。
因S/D法具有較高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到現(xiàn)有或新開發(fā)的純化工藝中等優(yōu)點(diǎn)[16]，人們便將這種滅毒方法用于血漿、血液制品和生物制品[8,17,18,19]。S/D法作為血漿病原體滅活技術(shù)，是最早得到醫(yī)療界的認(rèn)可，并投入臨床中的。因?yàn)镾/D法滿足了以下三點(diǎn)：①能完全有效滅活胞內(nèi)、胞外病原體及附著在細(xì)胞上的病原體；②所選試劑能選擇性地進(jìn)入細(xì)胞且不損傷細(xì)胞；③經(jīng)處理后的紅細(xì)胞不產(chǎn)生新抗原或者抗體，對(duì)人體無害。因?yàn)镾/D病毒滅活處理對(duì)多種不同的包膜病毒都能發(fā)揮有效的病毒滅活作用,且有良好的臨床安全性，因此其通過美國FDA許可,以用于濃縮的人血液Ⅷ因子的病毒滅活,并已廣泛用于生物制品的生產(chǎn)[9,10,11,12]。
在使用S/D法時(shí)需要注意：①待滅活的制品中，可能存在顆粒性物質(zhì)會(huì)將病毒包裹其中，這會(huì)使S/D試劑無法接觸到病毒。因此，需要對(duì)制品事先進(jìn)行1μm或更高的精度的過濾以避免這種風(fēng)險(xiǎn)。②加入S/D后制品應(yīng)充分混勻，如果加入S/D后再進(jìn)行過濾，應(yīng)確保過濾后S/D濃度仍在有效范圍內(nèi)。③S/D試劑要能夠與混合容器內(nèi)每一滴制品接觸（特別是罐壁、灌頂上附著的制品可能在滅活工藝結(jié)束后又滴入罐內(nèi)），因此通常是將加入S/D后的制品混合均勻后，泵入另外的容器內(nèi)恒溫，執(zhí)行滅活程序。④病毒滅活間與后面的生產(chǎn)工序間需要分開，以免造成交叉污染。
S/D法缺點(diǎn)也比較明顯：這種滅活方法僅對(duì)脂包膜病毒有效，對(duì)于非脂包膜病毒無任何效果。而且，雖然S/D法現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于臨床，但也存在基因毒性、處理物及其衍生物殘留﹑滅活后部分凝血因子減低等問題。
2.2低pH孵放技術(shù)
低pH孵放法，是一種化學(xué)病毒去除/滅活技術(shù)，常用于單克隆抗體的病毒滅活工藝。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的條件下，電荷會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生不可逆的改變，從而使病毒喪失侵染細(xì)胞的能力。簡(jiǎn)單來說，低pH孵放法是破壞病毒包膜的完整性、阻斷病毒與宿主受體結(jié)合的途徑，使病毒無法感染宿主細(xì)胞，起到滅活病毒的作用[20,21,22,23]。
低pH孵放法雖然因其操作過程簡(jiǎn)單、病毒滅活效果好，成為重組蛋白藥物純化工藝中常用的關(guān)鍵步驟，但低pH環(huán)境容易使重組蛋白不穩(wěn)定，產(chǎn)生聚體、降解等質(zhì)量問題。相比較而言，由于抗體類免疫球蛋白在低pH環(huán)境普遍表現(xiàn)更加穩(wěn)定，因此低pH孵放法主要應(yīng)用在IgG類產(chǎn)品。另外，低pH孵放法具有方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、容易操作等特點(diǎn)，已被用于偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、流感病毒等病毒的滅活[5,6]。
在工藝操作過程中需要注意：本方法對(duì)于無脂包膜類病毒作用微弱（僅部分非脂包膜病毒有效），但在工藝中的低pH（如pH 4）處理（有時(shí)加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果可能受pH值、孵放時(shí)間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素影響。隨著pH升高，滅活效果降低，隨著溫度升高，滅活效果升高，通常可以達(dá)到5~6LRV滅活效果。在pH 3.7、pH 3.8時(shí)，其滅活效果會(huì)受多因素干擾。而樣品中含有一定量的精氨酸時(shí)可以改善病毒滅活效果，即使在pH 4.0的條件下也有顯著的滅活效果。低pH孵放不僅可以滅活有脂包膜類病毒，還可以沉淀HCP、DNA等雜質(zhì)，對(duì)純化工藝中的雜質(zhì)去除也起到重要作用[5,6]。
2.3納米膜過濾技術(shù)
納米膜過濾技術(shù)是一種通過孔徑大小過濾來濾除病毒的技術(shù)，多用于血液制品和生物制品中的病毒去除，其可以有效去除非脂包膜病毒。作為生物制品凈化過程中最常用的技術(shù)之一，其目的是達(dá)到有效的凈化效果，保證生物制品的安全[25]。得益于生物治療產(chǎn)品如單克隆抗體、干細(xì)胞產(chǎn)品、血液成分、生物制劑和疫苗不斷增長的需求，未來幾年全球病毒過濾市場(chǎng)預(yù)計(jì)呈現(xiàn)增長的趨勢(shì)。
納米膜過濾是利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內(nèi)，從而達(dá)到去除病毒的效果[7]。納米膜過濾可以同時(shí)滿足病毒去除效果好、目的蛋白質(zhì)通過性高（回收量、過濾時(shí)間）、目的蛋白質(zhì)不變性的特點(diǎn)，另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒，無論病毒基因組是RNA還是DNA，基本靠孔徑大小來去除病毒，所以是當(dāng)前最可靠的病毒去除、滅活技術(shù)。根據(jù)目的蛋白的大小，可以選擇平均孔徑不同的濾膜。在濾過產(chǎn)品中，平均孔徑為20 nm左右的產(chǎn)品被稱為細(xì)小病毒濾膜。近年來，由于去除小病毒的需求的提高，這種產(chǎn)品得到了廣泛的應(yīng)用。其中平均孔徑35~50 nm的濾膜被稱為逆轉(zhuǎn)錄酶病毒濾膜[2,3]。
在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，為了提高蛋白回收率，需要暫停壓力，然后將流路切換到清洗緩沖槽進(jìn)行后沖洗。病毒過濾的最劣條件之一是高TMP（跨膜壓差）。近年來的報(bào)告表明，過濾過程中壓力的釋放及之后的再加壓都會(huì)影響病毒去除效果。特別是在添加細(xì)小病毒和噬菌體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，在壓力暫停后再次加壓，會(huì)從濾液中檢測(cè)出病毒粒子。這種現(xiàn)象不是某種病毒濾膜所特有的，而是所有病毒濾膜產(chǎn)品的普遍現(xiàn)象。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因在于，暫停壓力后，被截留在膜內(nèi)的病毒粒子會(huì)再進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)，離開膜壁，再次加壓后，附近若有粒徑較大的濾孔，病毒粒子又會(huì)通過而漏出膜外。當(dāng)然，這不意味著病毒粒子一定會(huì)漏出。病毒漏出與否、漏出量取決于過濾對(duì)象溶液的性質(zhì)、過濾壓力、壓力暫停時(shí)間、病毒種類、病毒滴度/量和病毒濾膜的種類[2][3]。
為了判斷生產(chǎn)工藝的影響，需要使用模擬實(shí)際工藝的縮小模型進(jìn)行病毒去除試驗(yàn)。如果生產(chǎn)工藝中有壓力釋放過程的話，做病毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要考慮這一因素。實(shí)際生產(chǎn)過程中的流路一般會(huì)有閥門，在模擬時(shí)可以使用旋塞來代替閥門，盡可能使用試驗(yàn)流路接近實(shí)際的生產(chǎn)環(huán)境。如果觀察到病毒漏出，可以通過改變過濾條件來降低或消除風(fēng)險(xiǎn)。壓力釋放的影響取決于具體情況，應(yīng)設(shè)想在預(yù)想不到的壓力釋放的情況下，是繼續(xù)過濾，還是更換濾膜，針對(duì)不同的蛋白提前采取對(duì)應(yīng)措施是有意義的。
2.4紫外燈照射法
紫外燈殺毒法的主要儀器是紫外線殺菌燈。紫外線殺菌燈通常也被稱為紫外線消毒燈或紫外線熒光燈，是一種利用紫外線的殺菌作用進(jìn)行滅菌消毒的燈具。紫外線殺菌燈消毒原理主要是在特定的波長范圍（燈波長為200~275nm,殺菌作用最強(qiáng)的波段是250~270nm）以及足夠高的劑量下，通過輻射損傷和破壞微生物的核酸功能來殺滅微生物等病原體[26]。具體來說，是紫外線對(duì)核酸的作用引起細(xì)菌和病毒等微生物細(xì)胞中DNA或RNA相鄰嘧啶分子間形成異常的化學(xué)鍵，從而阻礙DNA或RNA的復(fù)制，而且在紫外線燈殺菌的過程中還會(huì)產(chǎn)生臭氧，臭氧本身就能從外而內(nèi)的逐步破壞病毒結(jié)構(gòu)，從而造成微生物細(xì)胞死亡，以達(dá)到消毒的目的[13,14,15]。
常見的紫外線殺菌消毒屬于照射消毒，只需將紫外線殺菌燈照射需要消毒的物品，或在需要?dú)⒕镜沫h(huán)境放置紫外線殺菌燈（使用時(shí)可將紫外線消毒燈懸吊于處方上方1m或?qū)⑻幏街糜谧贤饩€消毒箱內(nèi)）即可。紫外線可集中很高的強(qiáng)度在短時(shí)間內(nèi)殺滅細(xì)菌和病毒，屬于純物理消毒方法[13]。
紫外線消毒具有性能穩(wěn)定、使用維護(hù)便捷、運(yùn)行成本低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),但是紫外線穿透能力弱，僅對(duì)直接照射的物體表面有消毒作用,所以消毒處方時(shí)應(yīng)保證每張?zhí)幏降恼磧擅婢艿秸丈洹Ａ硗猓贤饩€可對(duì)皮膚黏膜造成損害,因 此使用時(shí)應(yīng)避免直接照射到人[14,15]。
紫外線燈在使用過程中會(huì)產(chǎn)生臭氧。臭氧的濃度過高會(huì)使人產(chǎn)生頭暈、惡心等癥狀，甚至?xí)l(fā)呼吸道的病變。而長期錯(cuò)誤使用紫外線燈會(huì)對(duì)人眼睛產(chǎn)生危害：誘發(fā)結(jié)膜、角膜等疾病，嚴(yán)重的甚至?xí)绊懸暳Α２粌H如此，如果長期照射到皮膚上，輕者會(huì)出現(xiàn)紅腫、瘙癢等癥，重者甚至?xí)l(fā)皮膚癌[14,15]。
3.小結(jié)
當(dāng)前廣泛使用的病毒滅活方法有S/D法、低pH孵放法、膜過濾法、紫外法等，本文也對(duì)這些方法進(jìn)行了一些介紹。雖然每種病毒滅活方法都可以滅活常見的病毒，但每種方法都有其局限性。國內(nèi)IND申報(bào)時(shí)，一般選擇低pH和膜過濾這兩個(gè)工藝。國外進(jìn)行申報(bào)時(shí)，除了選擇低pH和膜過濾這兩個(gè)工藝，還需進(jìn)行層析工藝（層析法最常用的是親和層析和離子交換層析。層析法是目前常用的樣品不同組分分離技術(shù)，利用各組分與固定相親和力的差異或相互作用不同的原理，實(shí)現(xiàn)病毒與樣品分離的目的）。
去除/滅活病毒的理想方法有2個(gè)特性：①可以部分去除病毒或者破壞病毒的活性和結(jié)構(gòu)。②維持生物制品的生物活性、理化性質(zhì)。
當(dāng)掌握對(duì)某種病毒的精準(zhǔn)去除/滅活或能夠?qū)Ξa(chǎn)品中所有的病毒進(jìn)行去除/滅活，并保證產(chǎn)品功能性質(zhì)完整時(shí)，消毒后的產(chǎn)品才能具有效益和繼續(xù)增加效益。
