急性皮膚毒性試驗(yàn)可以確定受試物是否經(jīng)過(guò)皮膚吸收和短期作用產(chǎn)生的毒理毒情反應(yīng)，可以為化妝品原料毒性分級(jí)和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及確定亞慢性毒性試驗(yàn)和其他的毒理學(xué)試驗(yàn)劑提供依據(jù)，急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)是毒理檢測(cè)中的一種試驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目。下面為大家介紹GB／T 15670.5-2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法 第5部分：急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法。
急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法GB／T 15670.5-2017介紹
范圍
GB/T 15670的本部分規(guī)定了急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)的基本原則、方法和要求。本部分適用于為農(nóng)藥登記而進(jìn)行的急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)。
規(guī)范性引用文件
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GB 14925 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施
農(nóng)藥登記資料規(guī)定(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部令[2007]第10號(hào))
術(shù)語(yǔ)和定義
1、急性經(jīng)皮毒性（acute dermal toxicity）
經(jīng)皮膚染毒受試物連續(xù)接觸24小時(shí)所產(chǎn)生的健康損害效應(yīng)。
2、劑量（dose）
所給受試物的量,以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所接受受試物的質(zhì)量表示(mg/kg 體重)。
3、半數(shù)致死劑量（median lethal dose）
一次或在24小時(shí)內(nèi)多次給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物后,引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體中半數(shù)死亡的毒物統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量。用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重接受受試物的質(zhì)量表示(mg/kg體重)。
4、劑量-反應(yīng)關(guān)系（dose-response relationship）
劑量與特定效應(yīng)的發(fā)生率間的關(guān)系。
試驗(yàn)?zāi)康?/h3>
通過(guò)24小時(shí)內(nèi)連續(xù)經(jīng)完整皮膚染毒受試物,觀察受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性作用,初步了解受試物能否經(jīng)皮膚吸收和毒作用模式,為急性毒性分級(jí)、標(biāo)簽管理及其他毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的選擇提供依據(jù)。
試驗(yàn)概述
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試部位的被毛要在試驗(yàn)前去除，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成若干劑量組(至少3個(gè)組),每組涂布不同劑量的受試物﹐然后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒反應(yīng)和死亡情況,對(duì)試驗(yàn)中死亡和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死的動(dòng)物應(yīng)做大體解剖,計(jì)算LD和95%可信區(qū)間。
試驗(yàn)方法
1、受試物配制
液態(tài)受試物一般使用原液。固體受試物應(yīng)將其研磨成粉狀過(guò)100目篩,并用水或其他無(wú)毒、無(wú)刺激性、不影響皮膚通透性,也不與受試物反應(yīng)的介質(zhì)充分濕潤(rùn)，來(lái)確保受試物和皮膚達(dá)到良好的接觸。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
2.1、種屬和體重
首選大鼠,也可選白色家兔、白色豚鼠或非嚙齒類動(dòng)物。選用大鼠以外的臭他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)說(shuō)明理由。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重要求范圍分別為:大鼠200 g 300 g.白色家兔2.0 kg~3,0 kg豚鼠350 g~450 g。可選國(guó)內(nèi)常用品系。雌性動(dòng)物應(yīng)為未妊娠和未經(jīng)產(chǎn)的。
2.2、動(dòng)物性別
選擇最敏感的性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。不能確定時(shí),可提供兩種性別動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果;或先進(jìn)行一種性別動(dòng)物的試驗(yàn)后,再至少選擇另外一種性別的5只動(dòng)物在相同劑量下染毒,評(píng)估最敏感性別的動(dòng)物。如果有足夠的證據(jù)表明所試驗(yàn)的動(dòng)物性別肯定是最敏感的,可不必再進(jìn)行第二種性別的染毒試驗(yàn)。
2.3、飼養(yǎng)環(huán)境
正式試驗(yàn)前，動(dòng)物應(yīng)在試驗(yàn)環(huán)境中檢疫、適應(yīng)3d~5d時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件應(yīng)符合GB 14925的有關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)期間,為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相互抓撓、舔食,推薦采用單卷飼養(yǎng)。
3、劑量和分組
3.1、劑量
通過(guò)每劑量一只動(dòng)物的預(yù)試驗(yàn)確定劑量范圍。劑量設(shè)計(jì)可采用霍恩氏法,概率單位法等。至少應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量組,組間距應(yīng)根據(jù)受試物毒作用特征決定,但應(yīng)能保證動(dòng)物出現(xiàn)一定梯度的毒性作用和死亡率,以滿足計(jì)算半數(shù)致死劑量的需要。
3.2、限量試驗(yàn)
一般情況下﹐使用嚙齒類動(dòng)物時(shí),一次染毒兩種性別各5只動(dòng)物,2 000 mg/kg體重,或根據(jù)管理上的需要也可選擇5 000 mg/kg 體重劑量進(jìn)行試驗(yàn)。特殊情況下,限量試驗(yàn)可采用更高的劑量。如果沒(méi)有死亡發(fā)生,可結(jié)束試驗(yàn),不需要做多組試驗(yàn)。如果出現(xiàn)與染毒有關(guān)的死亡,需要進(jìn)行多個(gè)劑量的試驗(yàn)。
3.3、動(dòng)物分組
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組,大鼠或豚鼠每一劑量組(單性別)大于等于5只;家兔每一劑量組(單性別)大于等于4 只。
4、試驗(yàn)步驟
4.1、備皮
試驗(yàn)前24小時(shí),在動(dòng)物背部正中線兩側(cè)去毛,仔細(xì)檢查皮膚,要求完好無(wú)損,防止改變皮膚的通透性。染毒面積不應(yīng)少于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積的10%。應(yīng)通過(guò)對(duì)動(dòng)物體重的測(cè)定確定染毒部位的面積。
4.2、動(dòng)物的固定
染毒時(shí)應(yīng)采用必要的措施對(duì)動(dòng)物進(jìn)行適當(dāng)固定,并需要一定程度的松動(dòng),不推薦完全限制動(dòng)物活動(dòng)的方法。
4.3、染毒操作
將受試物均勻涂布于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的去毛區(qū),面積略小于去毛區(qū),記錄染毒面積。覆蓋一層不滲透材料后再以2層～8層的多孔夠布覆蓋,并用無(wú)刺激性膠布或者繃帶加以固定,保證到受試物與皮膚密切接觸，防止受試物揮發(fā)、脫落和被動(dòng)物舔食。接觸24 h后取下固定物和覆蓋物,用毫水或適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ宄つw上殘留的曼試物。在保證受試物與皮膚充分接觸的條件下,對(duì)毒性較大的受試物,可根據(jù)劑量相對(duì)減小染毒區(qū)域的面積。
5、試驗(yàn)觀察和檢查
5.1、觀寰期限
每天觀察一次，連續(xù)14d記錄史毒發(fā)生)發(fā)展過(guò)程，死選情況.觀察期限也不是團(tuán)定的，根據(jù)毒性反應(yīng)，反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時(shí)間可做出調(diào)鑒.如果動(dòng)物中毒反應(yīng)、死豢時(shí)間延遲(染毒后4 d后才顯示)，觀察期限應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)，最長(zhǎng)不超過(guò)21d。
5.2、觀察內(nèi)容
5.2.1臨床觀察
觀察至少包括皮膚.被毛、眼﹑黏膜的改變和呼吸系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng)﹑肢體活動(dòng).行為方式等變化發(fā)生的時(shí)間﹑程度和持續(xù)時(shí)間觀察的內(nèi)容包括：
a)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng).體位異常、叫聲異常、不安采滯,震顫、抽搐、麻痹、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、對(duì)外反應(yīng)過(guò)敏或遲鈍,是常行為如過(guò)度反復(fù)抓撓口周、梳理?yè)?甚至自殘﹑倒退行走等;
b)植物神經(jīng)系統(tǒng):瞳孔擴(kuò)大或縮小流涎或流淚；
c)呼吸系統(tǒng):鼻孔流液﹑鼻棚、鼻翼扇動(dòng),呼吸深緩、呼吸過(guò)速、蜂腰：d)泌尿生殖系統(tǒng):會(huì)陰部污穢、有分泌物、陰道腫脹;
d)泌尿生殖系統(tǒng):會(huì)陰部污穢、有分泌物、陰道腫脹;
e)皮膚和被毛:皮膚充血、紫紺.被毛蓬松或潮濕、污穢;
f)眼:眼球突出﹑結(jié)膜充血﹑溢血性分泌物﹑角膜混濁；
g)消化系統(tǒng):腹瀉、厭食。
應(yīng)特別注意染毒區(qū)皮膚的反應(yīng)。如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡或處于體弱、瀕死狀態(tài),應(yīng)及時(shí)與其他動(dòng)物分離，并記錄發(fā)生的時(shí)間,稱量體重,解剖檢查,以減少動(dòng)物同類互殘及死后組織自溶,避免動(dòng)物信息的丟失。如果死亡動(dòng)物不能立即進(jìn)行大體解剖檢查,應(yīng)保存在能夠減少自溶的低溫環(huán)境中(冷藏,不能冷凍),并在24h內(nèi)進(jìn)行解剖檢查。
5.2.2、體重稱量
應(yīng)分別在染毒前、染毒后(至少每周一次)和處死前稱量并記錄動(dòng)物體重。
5.3、病理學(xué)檢查
在試驗(yàn)期內(nèi)中毒死亡的和人道處死的動(dòng)物應(yīng)做大體解剖,記錄每只動(dòng)物的大體病理改變。染毒后存活時(shí)間大于等于24 h的動(dòng)物其器官顯示有大體病理改變﹐則需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,以便獲取有關(guān)毒作用的信息。必要時(shí)對(duì)染毒區(qū)和臨近非染毒區(qū)皮膚作組織學(xué)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果和評(píng)價(jià)
1、結(jié)果處理
1.1、妳用表格列出試驗(yàn)中獲得的各組(兩種性別或單性別)動(dòng)物的全部原始數(shù)據(jù),內(nèi)容應(yīng)包括:動(dòng)物編號(hào),性別、染毒劑量、體重,各種體征的有無(wú)及程度、死亡或存活狀況,大體解剖及組織病理學(xué)檢查時(shí)各病變的有無(wú)及程度。
1.2、分別統(tǒng)計(jì)各組及不同性別動(dòng)物的數(shù)量,體征發(fā)生、死亡、存活及大體解剖和組織病理學(xué)檢查的各類病變發(fā)生的頻數(shù)﹐計(jì)算不同組、不同性別動(dòng)物上述各項(xiàng)的發(fā)生率及不同時(shí)間的體重均值。
1.3、用適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.4、用適宜方法計(jì)算LDs值和95%可信區(qū)間。
2、結(jié)果評(píng)價(jià)
2.1、對(duì)受試物能否經(jīng)皮吸收及毒作用特點(diǎn)做出初步評(píng)價(jià)。
2.2、受試物的毒作用水平,如能得到劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線，可對(duì)急性經(jīng)皮毒作用閾值做出初步評(píng)價(jià)。
2.3、明確是以何種性別的動(dòng)物和接觸時(shí)間得到的毒性參數(shù)。
2.4、急性經(jīng)皮毒性級(jí)別按照《農(nóng)藥登記資料規(guī)定》中 3.3.2.8的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定。
試驗(yàn)報(bào)告
試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：
a)試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱與聯(lián)系方式，報(bào)告編號(hào)；
b)試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式,樣品受理日期和封樣情況；
c)試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人,簽發(fā)日期;d)試驗(yàn)摘要；
e)受試物名稱、有效成分美國(guó)化學(xué)文摘登錄號(hào)(CAS號(hào))(如已知),代碼(如有)、純度(或含量)、劑型、生產(chǎn)日期(批號(hào))、理化性質(zhì)、配制所用溶劑和方法；
f)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、級(jí)別﹑數(shù)量、體重、性別、來(lái)源(供應(yīng)商名稱﹑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)) ,檢疫、適應(yīng)情況,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境,包括溫度﹑相對(duì)濕度﹑飼料,單籠飼養(yǎng)或群飼、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)；
g)劑量和組別,包括選擇劑量的原則或依據(jù)、劑量和組別,動(dòng)物分組方式和每組每種性別動(dòng)物數(shù)；
h)試驗(yàn)條件和方法,包括主要儀器設(shè)備,染毒途徑,染毒方案、試驗(yàn)周期﹑觀察指標(biāo)等;
i)試驗(yàn)結(jié)果：以文字描述和表格逐項(xiàng)進(jìn)行匯總,包括臨床中毒表現(xiàn),中毒表現(xiàn)出現(xiàn)、持續(xù)和恢復(fù)時(shí)間,染毒后出現(xiàn)死亡的時(shí)間,體重變化,與劑量的相關(guān)性以及大體解剖和組織病理學(xué)改變等,指出結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理方法；
j)試驗(yàn)結(jié)論;給出明確結(jié)論,如LD。,95%可信區(qū)間和毒性分級(jí),必要時(shí)對(duì)有關(guān)問(wèn)題進(jìn)行討論；
k)原始記錄保存情況的說(shuō)明。
中科檢測(cè)是獨(dú)立第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，具有專業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)、業(yè)務(wù)對(duì)接以及技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)，具備開(kāi)展急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)的技術(shù)服務(wù)能力，具有一流的專業(yè)水平和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)，為客戶提供專業(yè)、高效、優(yōu)質(zhì)、全面的服務(wù)。
